Câu chuyện của Assassin’s Creed xoay quanh cuộc đối đầu định mệnh đã tồn tại suốt hàng trăm năm giữa hai kẻ thù truyền kiếp: Hội Hiệp sĩ Thánh chiến và Hội Sát thủ. Là tổ chức bí ẩn tập hợp những cá nhân ưu tú sở hữu quyền lực và địa vị cao trong xã hội, Hội Hiệp sĩ Thánh chiến mong muốn tạo ra thế giới lý tưởng không còn xung đột, bạo lực. Họ chủ trương thực hiện lý tưởng bằng sự cai trị tuyệt đối, sẵn sàng loại trừ bất cứ ai mang tư tưởng bất đồng, phản kháng. Xuyên suốt lịch sử tồn tại, Hội Hiệp sĩ Thánh chiến không ngừng tìm kiếm Quả táo Vườn Địa Đàng – thánh vật huyền thoại tương truyền là thứ chứa đựng hạt giống bất tuân của loài người. Họ tin rằng khi sở hữu trái cấm, bản thân có thể sử dụng quyền năng của nó để thao túng và thống trị toàn nhân loại. Trái ngược với Hội Hiệp sĩ Thánh chiến, Hội Sát thủ hoạt động với mục tiêu duy trì sự cân bằng của thế giới và tự do ý chí của loài người trước mưu đồ độc tài chuyên chế của Hội Hiệp sĩ. Chấp nhận ẩn mình trong bóng tối để hành động và phụng sự ánh sáng, Hội Sát thủ trở thành kẻ thù truyền kiếp, quyết không đội trời chung của Hội Hiệp sĩ. Ở thế giới hiện đại, Callum Lynch (Michael Fassbender) là một tử tù đang chờ đợi đến thời khắc bị hành quyết. Sau khi bị xử tử bằng hình thức tiêm thuốc độc, anh bất ngờ tỉnh lại và thấy mình đang có mặt tại cơ sở nghiên cứu của Abstergo Industries ở Tây Ban Nha. Abstergo thực chất là một tổ chức thuộc Hội Hiệp sĩ Thánh chiến thời hiện đại, có nhiệm vụ truy tìm Quả táo Vườn Địa Đàng thông qua việc truy hồi ký ức các sát thủ trong lịch sử từ hậu duệ của họ. Tiến sĩ Sophia Rikkin (Marion Cotillard), trưởng nhóm nghiên cứu tại Abstergo, tiết lộ với Callum Lynch rằng anh vốn là con cháu nhiều đời của Aguilar de Nerha – một sát thủ sinh sống và hoạt động tại Tây Ban Nha vào thế kỷ XV. Sophia tin rằng Aguilar là người cuối cùng từng nắm giữ Quả táo, cũng như biết được vị trí mà trái cấm được cất giấu. Thông qua cỗ máy đặc biệt có tên Animus, Callum có thể tái hiện ký ức của tổ tiên được lưu trữ trong mã gien di truyền của bản thân, qua đó khám phá bí mật về dòng dõi sát thủ.
